传统的给药途径存在选择性分布低、溶解度差、消除快等问题，并且会损伤邻近的健康组织。因此，可以将药物递送至目标位点的药物递送系统被广泛研究，以提高药物的生物利用度并减少其副作用。微米和纳米颗粒制剂作为传统药物或生物药的递送材料引起了人们的极大兴趣。微粒可用于制备可稳定数周至数月的长期储存制剂，并可通过肌内和/或皮下方法注射。纳米载体可以通过细胞内吞途径快速渗透细胞，并有效地将药物释放到局部微环境中。
基于 mRNA 的制剂的合理设计和应用最近在治疗人类疾病方面取得了一些关键成功。mRNA技术允许在体内直接生产蛋白质，从而避免了漫长的药物开发周期和复杂的生产工作流程。因此，mRNA 制剂可以显著改善迄今为止所使用的生物疗法。尽管 mRNA 具有许多优点，但其本质上是脆弱的，并且具有特定的递送要求。通过利用纳米生物技术的工程灵活性，mRNA有效载荷可以整合到纳米制剂中，这样它们就不会导致不需要的免疫反应，靶向目标组织，并且可以被递送到细胞质，从而提高安全性，同时增强生物活性。
合成 mRNA 技术代表了一个可用于开发先进药物产品的多功能平台。疫苗开发项目能够以惊人的速度设计和生产安全有效的 COVID-19 疫苗，这重新点燃了人们对 mRNA 技术的兴趣，特别是对于未来大流行的防范。尽管最近的研究和开发方法主要集中在提高 mRNA 疫苗和大规模生产能力上，但该技术也已用于开发各种免疫疗法、基因编辑策略和蛋白质替代疗法。mRNA 技术工具箱中有多个平台、设计原理和组件，可用于调节免疫原性、稳定性、原位表达和递送。
人工核酸纳米结构作为具有低细胞毒性和免疫原性的基因载体，已成为新兴的研究热点。最近在基于核酸的人工纳米载体的设计和功能机制方面取得了进展，特别是在外源 siRNA 和反义寡核苷酸递送方面。因此，不同的纳米载体正在靶向基因编辑以及抗肿瘤药物和小核糖核酸的共同递送中进行测试。在 SARS-CoV-2 出现之前，科学文献中已经详细描述了 mRNA 疫苗在快速大流行应对中的潜在用途；然而，在 SARS-CoV-2 爆发期间，我们目睹了该平台在真实大流行环境中的大规模部署。在临床试验中评估的三个 RNA 平台中（(1) 常规、非扩增 mRNA；(2) 碱基修饰、掺入化学修饰核苷酸的非扩增 mRNA；以及 (3) 自扩增 RNA (saRNA)），碱基修饰、非扩增 mRNA 技术的出现具有卓越的临床疗效。
如上所述，mRNA 技术主要有两种类型：常规 mRNA 和 saRNA。RNA 转录物的基本组成部分是 5' 帽和 5' 非翻译区 (UTR)、开放阅读框 (ORF)、3' UTR 和聚腺苷尾，所有这些都是原位蛋白质翻译所必需的。saRNA 需要编码来自甲病毒组基因组的四种非结构蛋白 (nsP1-4) 的序列形式的附加组件，这些蛋白形成 RNA 依赖性 RNA 聚合酶复合物，以及 5' 和 3' 保守序列元件，这两者都是RNA自我增殖所需的。编码目的基因的序列通常包含在亚基因组启动子控制下的 nsP1-4 下游。
合成 mRNA 的生产始于 DNA 模板的设计和合成，该模板编码噬菌体启动子下游转录物的必要成分（通常是 T7、T3 或 SP6）。然后，mRNA 可以通过高效且无细胞的过程（称为体外转录）从线性模板转录。最简单的形式是，这需要与模板中编码的启动子相对应的 RNA 聚合酶、三磷酸核糖核苷酸和适当的缓冲液。mRNA 的加帽可以在体外转录过程中使用共转录帽类似物来实现。或者，可以通过酶法添加 5' 帽。随后将纯化的 mRNA 配制在含有阳离子或可电离脂质以及赋形剂的混合物的脂质纳米颗粒中。进入靶细胞后，蛋白质立即使用宿主翻译机制进行翻译，并可以在细胞质内发挥作用，运输到细胞膜或细胞核，或分泌，具体取决于 mRNA 的设计。就 saRNA 而言，nsP1-4 蛋白的初始原位翻译确保了亚基因组 RNA 的指数复制和后续翻译。该平台的主要优点是宿主细胞细胞质中 mRNA 的原位翻译允许天然蛋白质折叠和转录后修饰。因此，治疗药物和抗原以通常分别模拟天然宿主蛋白和病毒表位的构象表达。其它关键属性，包括降低的基因毒性、灵活的模块化设计原则以及较小的生产占地面积，帮助 mRNA 平台克服了传统疫苗生产管线的限制。重要的是，该平台可能被视为疾病负担较重的发展中国家获得疫苗生产独立性的垫脚石。
除了传染病之外，所谓的基于 saRNA 的技术也已在多个方向进行了广泛测试，包括肿瘤预防和遗传性疾病的治疗。有趣的是，与传统mRNA技术相比，基于saRNA的技术被认为显示出更先进的RNA疗法，其剂量要求较低、副作用相对较少且效果持久。尽管如此，为了实现基于saRNA的药物在临床上的批准，仍然需要克服一些挑战。
脂质纳米颗粒（LNP）已成为一种非常有前途的递送方法。然而，当静脉注射 LNP 时，大部分载荷被肝脏截留。或者，将它们直接注射到大脑等器官中，需要更具侵入性的程序。因此，开发更具特异性的 LNP 对于其未来的临床应用至关重要。修改 LNP 中的脂质成分可以将 LNP 更特异性地递送到某些器官（图 1）。
图 1. mRNA 的 LNP 配方。成分通过微流控装置的混沌混合进行混合。然后脂质纳米颗粒与真核细胞的脂质双层发生相互作用。融合过程将纳米颗粒的脂质与细胞膜中的脂质融合，最终向细胞内释放纳米颗粒的内容物。当纳米颗粒被静电力吸引到细胞膜上时，就会发生吸附，最终促进内部物质的释放。当来自细胞膜的脂质和来自纳米颗粒的脂质交换时，就会发生脂质交换。当吞噬细胞吞噬纳米颗粒时，就会发生内吞作用。包含靶向部分（旨在结合细胞类型上适当受体的靶细胞特异性仿生配体）通常被称为纳米颗粒表面“功能化”或“装饰”，旨在改善纳米颗粒的靶向递送RNA 载荷。
mRNA非病毒递送方法
信使 RNA (mRNA) 作为治疗和预防多种人类疾病的疗法具有巨大的潜力，可用于蛋白质替代、疫苗接种、肿瘤免疫治疗和基因组工程。尽管基于 mRNA 的疗法的设计取得了进展，但其广泛转化为临床应用的一个关键方面是开发安全有效的递送策略。为此，包括肽复合物、脂质或聚合物纳米颗粒以及混合制剂在内的非病毒递送系统引起了越来越多的兴趣。尽管与基于病毒的系统相比，其功效有所降低，但非病毒载体在生物安全性和多功能性方面提供了重要的优势。
在本文中，我们将概述当前 mRNA 治疗应用，并讨论递送的关键生物障碍和非病毒系统开发的最新进展。mRNA 的经典治疗应用是蛋白质替代策略、疫苗生产和基因编辑（图 2）。
图 2. 脂质纳米颗粒介导的寡核苷酸和 mRNA 治疗药物的递送。RNA脂质纳米颗粒技术可用于诱导和抑制基因产物的表达。特别是，在肿瘤中，蛋白质抗原表达可用于免疫治疗，为宿主抗肿瘤免疫反应创造靶标。同时，siRNA还可用于抑制恶性基因的特异性表达。
蛋白质 mRNA 非病毒递送方法
在蛋白质替代中，体外转录的 mRNA 用于诱导蛋白质的表达，该蛋白质的功能障碍或缺失决定了特定的病理状况。mRNA 诱导的蛋白质表达也已应用于细胞重编程，目的是调节细胞命运和功能。2012 年诺贝尔奖获得者山中伸弥和Gurdon首次描述了这种方法。作者证明，在人类体细胞中引入 OCT4、SOX2、MYC 和 KLF4 转录因子（表示为山中因子混合物）可诱导其在诱导多能干细胞中重新编程。基于这些发现，编码转录因子混合物的 mRNA 已被用于产生诱导多能干细胞。类似的方法也被开发用于其它细胞类型的重编程。正如稍后讨论的，吸入 LNP 通过蛋白质靶标 CFTR 治疗囊性纤维化的 I/II 期临床试验正在进行中。（囊性纤维化跨膜电导调节蛋白或 CFTR 蛋白有助于维持体内许多表面（例如肺表面）的盐和水的平衡。当该蛋白不能正常工作时，氯（盐的一种成分）就会变成被困在细胞里。）
基于 mRNA 的疫苗
传统病毒疫苗依赖于安全有效地施用完整（灭活或减毒）或部分（亚单位）病毒作为免疫系统的“训练”工具。然而，这些策略往往开发缓慢，很难跟上新出现的病毒株的步伐。相比之下，基于 mRNA 的纳米医学平台的有效载荷互换性可以显著简化开发过程。通过基因测序可以快速发现最佳疫苗靶点，快速生成后续大规模 mRNA 生产的模板。快速的发现过程，与 LNP 制剂相对便宜的生物生产成本相结合，使 mRNA 候选疫苗能够比传统疫苗更快地进行临床测试并获得监管授权。最近开发和部署用于对抗 COVID-19 大流行的 Pfizer-BioNTech BNT162b2 和 Moderna mRNA-1273 mRNA 疫苗就是例证。两种疫苗均含有核苷修饰的 mRNA，可诱导全长SARS-CoV-2 刺突蛋白的膜结合表达。在每种情况下，mRNA 疫苗均使用 LNP 制剂用于肌肉注射。这些疫苗的快速开发和有效功效将为未来针对多种疾病的、基于 mRNA 的疫苗的开发奠定强有力的基准。尽管这些疫苗取得了巨大成功，但冷冻储存和解冻后短期可用的需求构成了全球广泛分发的障碍。幸运的是，我们正在做出巨大努力来克服这些挑战，并且正在积极开发其它基于 mRNA 的针对 COVID-19 的纳米疫苗。
此外，为了提高基于 mRNA 的疫苗的功效，正在开发其它策略，例如自扩增 mRNA 疫苗。自扩增 mRNA 疫苗使用工程化的 RNA 病毒基因组，其中插入目的抗原的基因来代替编码病毒结构蛋白的基因，同时保持病毒 RNA 复制机制的基因完整。与传统的基于 mRNA 的疫苗相比，自扩增 mRNA 疫苗允许抗原编码 RNA 在细胞内复制，从而产生更高水平的抗原，从而增强疫苗功效。由于病毒结构蛋白基因被去除，因此不可能产生感染性病毒颗粒，从而确保了安全的疫苗特征。然而，与mRNA疫苗相比，自扩增mRNA疫苗表现出一些困难。由于存在用于 RNA 复制机制的病毒衍生基因，它们必然具有更大的分子尺寸，这也可能导致免疫原性，从而限制它们潜在的重复使用。迄今为止，自扩增mRNA疫苗平台已应用于多种病毒，包括流感、埃博拉、丙型肝炎、狂犬病病毒、弓形虫、人类巨细胞病毒和HIV-1等。
肿瘤免疫疗法是 mRNA 疫苗的另一个有前景的应用。迄今为止，基于 mRNA 的肿瘤免疫疗法已采用两种不同的策略。第一个利用编码肿瘤相关抗原的 mRNA。mRNA 在树突状细胞等抗原呈递细胞中离体转染，以激活细胞毒性 T 细胞 。基于 mRNA 的肿瘤免疫疗法的第二种策略涉及产生表达嵌合抗原受体 (CAR) 的修饰 T 细胞，这些嵌合抗原受体 (CAR) 来源于结合特定肿瘤表位的蛋白质片段和选定的 T 细胞受体结构域的融合。该程序需要通过病毒/非病毒基因转移或通过体外转录 mRNA 的直接转移，用 CAR mRNA 对患者来源的 T 细胞（CAR T 细胞）进行离体遗传修饰。随后进行细胞扩增并重新输注给患者。输注的 CAR T 细胞决定抗肿瘤免疫反应，靶向肿瘤细胞。
用于基因编辑的 mRNA
除了蛋白质替代和疫苗之外，最近，CRISPR（成簇规则间隔短回文重复）技术的发展推动了 mRNA 在基因编辑中的应用，并扩展了其在不仅需要蛋白质表达还需要基因敲除的病理学中的应用。
基本的 CRISPR 系统被发现是一种细菌防御机制，需要表达编码核酸酶 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 的 mRNA 以及将核酸酶引导至特定 DNA 位置的短引导 RNA (gRNA)。然后被切割。传统上，使用包含 Cas9 基因和 gRNA 的 DNA 质粒。由于 Cas9 的持续表达，该系统受到基因组内潜在的不需要的切割的限制。因此，由于 mRNA 的瞬时性，使用编码 Cas9 或其它核酸酶的 mRNA 已被提议作为减少脱靶效应的有效替代方案。
基于 CRISPR/Cas9 技术，Gillmore 及其同事开发了一种名为 NTLA-2001 的基因编辑治疗药物，它可能是第一个治疗 ATTR（转甲状腺素蛋白）淀粉样变性的药物。该药物利用脂质纳米颗粒，设计用于将两部分基因组编辑系统递送给基因组编辑系统，该系统包含编码 Cas9 蛋白的人类优化 mRNA 分子和专门针对编码转甲状腺素蛋白 (TTR) 的人类基因的单引导 RNA 分子。根据作者在临床前体外和体内研究中获得的数据，NTLA-2001 可能能够通过单次给药产生有效且持久的 TTR 表达敲低。该治疗的安全性非常令人满意，因为在分析的患者中仅发生了少量且非常轻微的不良反应。
原文：M.Puccetti, A.Schoubben, S.Giovagnoli, et al., Biodrug Delivery Systems: Do mRNA Lipid Nanoparticles Come of Age? International Journal of Molecular Sciences, 2023.
