先天性肺部疾病如表面活性蛋白缺乏症、囊性纤维化(CF)和 α-1抗胰蛋白酶缺乏症可导致终身发病率和死亡率。虽然这些疾病的遗传起源已经确定，但是有效的治疗方法仍然难以找到。气管内递送基因编辑工具，特别是 CRISPR-Cas9到气道上皮细胞或其他肺细胞提供了一种有希望的纠正方法，为患者提供终身健康和生活质量益处。已经使用病毒载体如腺相关病毒(AAV)实现了体内基因编辑，但是这些稳定的基于 DNA 的载体导致 Cas9核糖核酸酶和单引导 RNA 在细胞中的长期表达。虽然编辑机器的长期暴露可能有利于基因校正率，但也可能导致脱靶基因改变的积累。此外，AAV 衣壳的免疫原性触发中和抗体和 T 细胞应答，限制基于 AAV 的治疗的重复给药; 然而，由于更高的细胞周转率，肺中的基因编辑受益于重复给药。此外，尺寸限制对于将有效的产脓链球菌 CRISPR-Cas9(spCas9)构建体整合到 AAVs12中提出了挑战。这些限制可以通过非病毒、基于信使 RNA 的传递平台来克服，这些平台可以实现瞬时表达和重复给药。脂质纳米颗粒(LNPs)是临床上最先进的非病毒载体，正如 Modelna 和辉瑞/BioNTech 开发的广泛接受的 mRNA 疫苗技术所见，并且在 Cas9肝脏基因编辑平台中显示出巨大的希望。然而，一种基于 LNP 的 Cas9递送系统用于有效的肺基因修饰尚未见报道。与肝脏相比，肺由于其特殊的细胞类型、粘液屏障和粘液纤毛清除而对分娩构成独特的挑战。

我们合成并筛选了一个可生物降解的可电离脂质的组合文库，用于构建用于肺 mRNA 传递的纳米颗粒。铅脂制剂适合于多种气管内给药，并且可以有效地将 Cre 或 Cas9 mRNA 递送到小鼠气道上皮。在这项工作中，我们设计了一个三组分反应(3-CR)系统，其中硝基蓖麻油丙烯酸酯(NRA)接头与脂肪醇(脂质尾) ，然后与含有初级，二级或三级胺的头基连接(图1a，b)。与传统的将胺头基直接与脂质尾缀合的双组分反应相比，该3-CR 系统简化了繁琐的合成过程，增加了脂质结构多样性，并迅速产生了结构多样的可生物降解电离脂质组合文库。我们合成了包含 NRA 接头的720个新脂质的文库，其具有10个不同的尾(不饱和键的长度，饱和度和位置可变)和72个头基(环状结构，芳香性和功能基团可变)(补充图1)。该文库中的所有可电离脂质都含有大量的酯基和碳酸基，以改善可电离脂质的生理生物降解性。这降低了不良反应的可能性，增强了与多剂量方案的相容性。

图1c 提供了生物评估的可视化概述。为了鉴定铅候选物，按照经典配方比例19制备包含新的可电离脂质ーー1,2-二油酰基 -sn-甘油 -3-磷酸乙醇胺(DOPE) ，C14-PEG2000和胆固醇ーー的 LNPs，并装载萤火虫萤光素酶 mRNA (mLuc)。用 mLuc-LNPs 处理 A549细胞，用 Bright-Glo 测定法过夜孵育后测定荧光素酶表达(图1d)。为了选择体内测试的有希望的例子，这些新的 LNPs 被分类为72个不同的可电离脂质的胺头基团(A1-A72) ; 每个头基类中的可电离脂质含有相同的胺头基团但不同的脂质尾(T1-T10)。命中率的百分比由具有相对发光单位(RLU) > 50,000(1至10)的脂质的数量除以每组中的脂质总数(10)来计算。选择脂质变异中命中率至少为80% 的头部组进行进一步的动物筛选(图1e)。为了加快筛选，我们采用了一种正交的基于批处理的检测策略，这大大减少了所需的动物数量和鉴定铅 LNPs 所需的时间。首先，将携带相同头基的 mLuc-LNPs 合并成15批(每批10个 LNPs)并肌肉注射到小鼠体内。6小时后，通过 IVIS 成像(图1f 和补充图2)在注射部位的发光信号测量每个簇的转染效力，鉴定8个突出的胺头基团(感兴趣区域(ROI) > 6 × 106 p s-1 cm-2 sr-1，其中 p 是光子，sr 是甾体)。类似地，将携带相同脂质尾巴的脂质合并成十批(每批八个 LNPs)并肌肉内注射到小鼠中(图1g 和补充图3) ，鉴定出七个突出的脂质尾巴(ROI > 9 × 106p s-1cm-2sr-1)。

之前的工作表明，用阳离子脂质1,2-二油酰基 -3-三甲基丙烷(DOTAP)取代 DOPE 可以有效地增加全身给药后 mLuc-LNPs 在肺中的转染效力20。在这里，我们按照报道的 DOTAP 制剂重新配制了主导 LNP，RCB-4-8，发现气管内给药后肺中的萤光素酶表达也进一步改善(补充图7a) ，可能是因为阳离子脂质的组成可以增强肺细胞内化和粘液保留的 LNPs。这种制备 RCB-4-8 LNPs 的 DOTAP 制剂是拥有属性动态光散射和低温透射电子显微镜(补充图7b-d) ，并被用于这项工作的其余研究。在微流体中产生的 LNPs 比直接移液管混合产生的 LNPs 具有更小的尺寸，更低的多分散性指数和稍高的封装效率(补充图7b)。在剂量反应测定中，与用 DLin-MC3-DMA (MC3)配制的 LNPs 相比，RCB-4-8mLuc-LNPs 提高了约100倍的肺转染效率，所述 DLin-MC3-DMA 是美国 FDA 批准用于 RNA 递送的可电离脂质(图1j 和补充图8)。RCB-4-8 LNP 介导肺中 mRNA 转染的效力比最近开发的用于肺 mRNA 传递的另一种 LNP 制剂高出10倍以上21。此外，给药后48小时，可生物降解的 RCB-4-8在肺中保留 < 30% ，而同一时间点 MC3的保留率 > 90% (补充图9) ，表明毒性较低。

肺部有效的基因编辑提供了靶向几种遗传性疾病的手段22。作为复杂基因编辑方法的代理，我们通过气管内递送 RCB-4-8 LNP 检测了 Cre 重组酶 mRNA (Cre-mRNA)介导的编辑。为了在体内直观地检测基因编辑，我们气管内给予装载有 Cre-mRNA (LNP-Cre)的 LNPs 至 Lox-3xSTOP-Lox (LSL)-tdTomato (Ai9)报告小鼠23。从 mRNA 翻译的 Cre 重组酶可以催化遗传重组去除 LSL 盒，导致 tdTomato 的表达，tdTomato 是转基因细胞中信号的红色荧光蛋白增益(图2a)。用 LNPs-Cre 给予小鼠一次(LNP-Cre × 1)或三次(LNP-Cre × 3)超过4天。我们在最后一次给药后3天收集肺组织，并通过流式细胞术检测 tdTomato 的表达。结果显示，LNP-Cre × 1和 LNP-Cre × 3可分别在总肺细胞的42.0 ± 3.0和53.0 ± 6.0% 中导致 tdTomato 阳性(tdTomato +)表达(图2b 和补充图10) ，其高于两倍以上由聚合物聚合物递送的 Cre-mRNA (? 20%)24。此外，为了研究编辑细胞的细胞分布，在冻存的肺切片中可以观察到 tdTomato 和细胞核(DAPI)。LNP-Cre 导致气道中 tdTomato 信号分布均匀，而多次给药显着增加了 tdTomato + 细胞的数量(图2c)。为了进一步验证这一结果，我们还对肺组织切片进行了免疫组织化学染色，结果显示 LNP-Cre × 1和 LNP-Cre × 3的 tdTomato + 细胞平均分别为17% 和39% (图2d，e)。重要的是，大气道(35%)和小气道(22%)可以在三倍剂量的 LNP-Cre 后进行编辑(补充图11a-c)。

俱乐部细胞和纤毛细胞是肺气道上皮细胞的两种主要亚型。纤毛细胞沿着细支气管上皮移动粘液，不能自我更新或转分化以应对损伤26。杆状细胞通过分泌杆状细胞分泌蛋白来保护上皮细胞，并且在损伤后可以分化成纤毛细胞来再生细支气管上皮细胞27。Clara 细胞分泌蛋白(CCSP)和乙酰化微管蛋白分别是杆状细胞(以前称为 Clara 细胞)和纤毛细胞的标志物28。使用针对 tdTomato 和 CCSP 或乙酰化微管蛋白的抗体检测石蜡固定肺切片中的编辑细胞(双阳性)。在共聚焦和标准荧光显微镜下，我们在大气道(图2g，h 和补充图11d-g)中分别观察到13.3 ± 2.4和10.4 ± 1.9% 的双阳性杆菌和纤毛细胞。总之，这些数据表明 RCB-4-8 LNP 可以将 mRNA 递送到呼吸道上皮的各种细胞类型，并诱导这些细胞中功能蛋白的有效表达。

这项工作证明了结合合理的设计和 high throughput 的力量，以改善体内性能的可电离核糖核酸的 mRNA 传递。我们以前发现，在可电离脂质尾中掺入炔结构可以增加纳米颗粒的融合性，从而促进 mRNA 载体的内体逃逸。然而，含炔烃的可电离脂质(例如 A6)仅当与经典的含烯烃的不可生物降解的可电离脂质如 MC3或 cKK-E12.相比之下，RCB-4-8表明，含炔烃的可电离脂质也可以单独工作，以实现有效的 mRNA 传递。此外，RCB-4-8中的次级碳酸盐基团允许其保留支化尾巴用于 mRNA 递送的优势，同时比具有次级酯基的脂质更具生物降解性，这些脂质在生理环境中降解相对较慢。

为了使这些 LNP 制剂的气管内给药更具临床相关性，我们目前正致力于提高 LNP 制剂雾化的稳定性。我们预计这将使患者能够接受基因治疗，只需通过雾化吸入 mRNA LNPs。另一方面，许多肺部疾病，例如肺纤维化(CF) ，会导致拥有属性粘稠的粘液积聚，对肺部基因的传递带来额外的挑战。未来的工作将探索 LNP 制剂在具有异常粘液的患病动物模型中的表现。总之，我们已经合成和评估了720种可生物降解的可电离脂质的文库，其中 RCB-4-8被鉴定为能够在肺中进行高效的肺 mRNA 递送和基因编辑，使用含炔烃的可电离脂质作为用于有效 mRNA 转染的唯一可电离化合物。与导致持久 Cas9表达的基于 DNA 的 AAV 递送系统相比，mRNA 的寿命相对较短，限制了积累脱靶基因改变的可能性。此外，与 AAV 不同，LNPs 提供了重复给药的可能性，这可能是实现肺部治疗编辑水平的必要条件。我们已经表明，RCB-4-8可以将 Cas9系统递送到肺中的纤毛和俱乐部上皮细胞，表明其可能使各种气道疾病(包括 CF (纤毛上皮细胞))的基因编辑成为可能。

此外，我们已经开发了用于 Cas9介导的肺中基因编辑的病毒和非病毒联合递送系统，其提供了双重递送方法来限制组织外靶向编辑，同时限制 SpCas9的表达。RCB-4-8 LNP 是一种有效的肺上皮基因编辑非病毒递送系统，为先天性肺部疾病的治疗开辟了新的途径。进一步的研究正在进行，以测试 RCB-4-8 LNP 是否能够转导小鼠和非人灵长类动物气管中的基底细胞。