一、脂质体药物背景介绍
1.1脂质体药物定义及结构
脂质体（liposome）是一种人工合成的，主要由具有亲水性的头部和疏水特性尾部的两性分子形成的人工膜，一般由磷脂、胆固醇、PEG等组分组成。当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体(如图1)。脂质体药物是通过使用人工生物膜将药物封包于内，形成微型囊泡结构的药物。
图1 脂质体的结构[1]
1.2脂质体药物的特点及应用
当脂质体作为药物制剂时,由于本身的两亲性,能够与各种各样的生物活性化合物结合，如图2。脂质体表面可以通过聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)修饰进行功能化,来构造隐形脂质体(stealth liposome)，并可以通过与配体(如抗体、多肽、蛋白质、碳水化合物以及各种小分子)链接促进受体介导的药物内吞作用实现靶向目的。同时一些亲水性的、疏水性的以及两亲性的药物可以分别包封在内部水腔中、磷脂双层内或者直接结合到脂质体表面来进行药物递送。
图2 脂质体给药的结构特点和设计理念[2]
由于脂质体具有靶向、降低药物毒性、提高药物稳定性、缓释作用等特点，其被广泛的作为载体应用于抗肿瘤药物、抗心脑血管疾病药物、抗精神疾病药物、抗菌药物和疫苗的递送。目前中国已经上市多种脂质体药物，有盐酸多柔比星脂质体注射液、注射用紫杉醇、两性霉素B脂质体、盐酸伊利替康脂质体注射液、盐酸米托蒽醌脂质体注射液。
二、脂质体药物分析策略和平台
脂质体药物进入机体后至少存在3种形态，即释放出的游离药物、含药物的脂质体（包裹型药物）和不含药物的脂质体空载体。通常，在血液或正常组织内释放的游离药物浓度是与不良反应程度呈正相关的，而在肿瘤组织等靶器官内释放的游离药物浓度是与药效呈正相关的，释放的游离药物是评价脂质体药物药效和毒性的关键信息[3]。近年越来越多的研究表明，组成脂质体的聚合物材料并非是没有活性的情性物质。聚合物材料可影响负载药物的吸收、分布、代谢、排泄过程,从而导致药物疗效的改变和一些不良反应的产生，聚合物材料本身也会与机体内的一些生物大分子直接发生相互作用,例如大多数的聚合物材料都会影响细胞色素P450酶的活性,有些聚合物材料甚至能够不同程度地抑制或增强不同亚型P450酶的活性，直接影响药效,甚至导致一些有毒代谢产物的生成。此外,也有研究表明,脂质体的重要组成材料聚乙二醇(PEG)会显著抑制P-糖蛋白的活性,影响药物在体内的运输过程,而且长期服用还会导致机体产生肾蓄积毒性[4]。因此，准确定量不同形态的脂质体药物，以及载体中的主要成分非常重要。
对于脂质体药物，在各种生物基质中游离药物浓度的测定、脂质体包裹型药物的浓度、二者总药物浓度的测定，为药代动力学（pharmacokinetics,PK）和毒代动力学（toxicokinetics TK）评估提供必要的信息。
对于体内游离型或包裹型药物的测定主要包括直接法与间接法。直接法是分别测定游离型药物和载药粒子中的包裹型药物，更能准确体现暴露量；间接法是测定总药物浓度和游离型药物浓度，取二者差值即为包裹型药物浓度。为保证测定的准确性，两种方法在样品处理和分离过程中需确保载药粒子、游离型药物、解聚材料等不同形态成分的状态不能发生变化[5]。FDA相关指导原则[6]建议对于脂质体新药检测目标应为总药与游离药物，对于脂质体仿制药检测目标应为游离药物与脂质体包裹药物。
三、脂质体药物生物分析方法
液质联用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LCMS）是测定生物基质中小分子药物的主要方法，但由于在样品前处理环节，药物分子易从脂质体中泄漏，进而干扰游离药物的准确测定。因此，包裹药物和游离药物的有效分离是实现对游离药物准确定量检测的关键。固相萃取(Solid phase extraction, SPE)是分离血浆中脂质体包裹和游离药物的常用方法。脂质体表面通常被亲水基团所覆盖,极性大,在SPE填料上没有保留，而游离药物极性小,能够保留在SPE填料上,利用二者保留行为的差异,可以实现有效分离[3]。
3.1游离型药物的分析
在游离药物检测时，脂质体在储存及样品处理过程中的稳定性十分关键。脂质体的稳定性与多种因素相关，如pH、温度、共存化合物、渗透压等。在这些因素中，储存温度、pH以及冻融最为重要。
对于检测血浆中游离药物的含量时，如图3(a)，通常使用的是SPE法，即将含脂质体的血浆样品上样到SPE板，当样品通过后，游离的药物被保留在SPE板上，随后将这些吸附在填料上的药物从SPE板上洗脱出来进行液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）分析。
3.2 包裹型药物分析
对于检测血浆中包裹型药物的含量时，如图3（b）,将含脂质体的血浆样品上样到SPE板后，由于包裹型药物脂质体表面的亲水基团，脂质体整体便会穿过SPE填料。上样时即刻收集通过的液体，将其蛋白沉淀后通过液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）分析，即可得到包裹型药物的数据。
3.3总药的分析
对于检测血浆中总药的含量时，如图3（c）脂质体的结构在高有机相或强酸强碱体系下便会破碎，从而释放出药物，因此蛋白沉淀的方法能同时提取到游离药物以及包裹型药物, 测得总的药物浓度。
3.4聚乙二醇化脂质和阳离子脂质分析
聚乙二醇化（PEG化）脂质和阳离子脂质均可选择蛋白沉淀或者液液萃取的方式进行提取。为了得到较好的回收率，针对不同的分析对象，其提取过程需要经过仔细的条件摸索。同时脂质分子的溶解度及残留问题在定量分析过程中需要多加关注，溶剂及流动相的选择在脂质检测的过程中也显得尤为重要。
药明康德生物分析团队具有完整的生物分析平台，在脂质体药物药代动力学和毒代动力学研究中，有丰富的LC-MS/MS分析方法建立和样品分析经验。目前已支持多个脂质体药物的临床前以及临床的生物分析工作，涉及工作包括脂质体给药后游离药物和包裹型药物的准确定量，聚乙二醇化脂质，阳离子脂质的分析，助力脂质体药物的研发和申报。
四、总结
脂质体类药物因其靶向、降低药物毒性、提高药物稳定性、缓释作用等特点使其应用越来越广泛的同时，也给生物分析方法的建立带来挑战。其挑战主要体现在分析组分的复杂性，需要有合理的实验设计以获得充分的数据评估药物代谢特点，其中控制脂质体的稳定性、即控制样品处理过程中脂质体包裹态药物的释放是方法建立成功的关键。药明康德生物分析部在脂质体药物分析积攒了丰富的经验，可以根据客户需求，结合项目特点，制定合理的分析策略，提供全方位的药物研发生物分析解决方案。
参考文献：
[1] A. D. Bangham, M. M. Standish, J. C. Watkins. Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids[J]. Journal of Molecular Biology,1965, 13(1): 238-252.
[2] Ağdaş M, Sezer A D, Bucak S. Liposomes as Potential Drug Carrier Systems for Drug Delivery[J], 2014. 5
[3] 王静，盐酸多柔比星脂质体和前列地尔脂微球生物质谱分析方法研究
[4] 张志,张瑀峣,顾景凯,脂质体药代动力学分析方法研究进展
[5] 纳米药物非临床药代动力学研究技术指导原则(试行) 202108[6] Drug Products, Including Biological Products, that Contain Nanomaterials Guidance for Industry
