T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)活性定量检测试剂盒介绍

检测原理：

T7 RNAP活性是T7表达系统的重要参数，其活性大小直接影响到T7表达系统对外源基因的转录(mRNA制备)和表达(重组蛋白的制备)的效果。对于T7 RNAP活性的检测，尤其是在混合液(制备mRNA的反应液、细胞破碎液等)中的T7RNAP活性原位检测由于干扰因素过多，很难实现T7 RNAP的定量检测。本试剂盒是利用了T7表达系统的特异性，在特殊的体系中将T7RNAP活性含量与表达的绿色荧光蛋白量关联起来，通过检测荧光响应值定量计算出T7 RNAP活性。检测原理流程如下^[1]：

适用体系：

试剂盒所用反应试剂是经过几十种成分优化并添加了独特的抗干扰试剂制备而成，对样品中存在的其它物质有很好的抗干扰能力。所以与以往检测T7 RNAP活性的方法不同，本试剂盒不但可以测定纯化的T7RNAP样品，还可以直接测定混合物中含有T7 RNAP的样品，其中包括：

①    测定纯化的T7RNAP溶液中T7 RNAP活性含量

②    测定用T7转录系统制备mRNA过程中反应液中的T7 RNAP活性含量

③    测定表达了T7 RNAP菌体样品中的T7 RNAP活性含量

应用场合：

l  本试剂盒可以用于制备T7 RNAP过程中，纯化的T7 RNAP试剂样品的质量监测

l  为T7表达系统表达外源蛋白过程的分析提供T7 RNAP活性含量定量数据

l  指导T7独立表达系统的理性构建

l  T7表达系统为基础的无细胞催化研究中反应条件的优化及反应过程分析

l  T7 RNAP基因突变以及分子定向进化对T7 RNAP活性的影响研究

l  mRNA制备过程的工艺优化及生产质量监控

l  mRNA疫苗制备和生产过程工艺条件优化和质量控制等

T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)活性定量检测试剂盒使用说明

检测原理：

T7 RNAP活性是T7表达系统的重要参数，其活性大小直接影响到T7表达系统对外源基因的转录(mRNA制备)和表达(重组蛋白的制备)的效果。对于T7 RNAP活性的检测，尤其是在混合液(制备mRNA的反应液、细胞破碎液等)中的T7RNAP活性原位检测由于干扰因素过多，很难实现T7 RNAP的定量检测。本试剂盒是利用了T7表达系统的特异性，在特殊的体系中将T7RNAP活性含量与表达的绿色荧光蛋白量关联起来，通过检测荧光响应值定量计算出T7 RNAP活性。检测原理流程如下^[1]：

适用体系：

试剂盒所用反应试剂是经过几十种成分优化并添加了独特的抗干扰试剂制备而成，对样品中存在的其它物质有很好的抗干扰能力。所以与以往检测T7 RNAP活性的方法不同，本试剂盒不但可以测定纯化的T7RNAP样品，还可以直接测定混合物中含有T7 RNAP的样品，其中包括：

④    测定纯化的T7RNAP溶液中T7 RNAP活性含量

⑤    测定用T7转录系统制备mRNA过程中反应液中的T7 RNAP活性含量

⑥    测定表达了T7 RNAP菌体样品中的T7 RNAP活性含量

应用场合：

l  本试剂盒可以用于制备T7 RNAP过程中，纯化的T7 RNAP试剂样品的质量监测

l  为T7表达系统表达外源蛋白过程的分析提供T7 RNAP活性含量定量数据

l  指导T7独立表达系统的理性构建

l  T7表达系统为基础的无细胞催化研究中反应条件的优化及反应过程分析

l  T7 RNAP基因突变以及分子定向进化对T7 RNAP活性的影响研究

l  mRNA制备过程的工艺优化及生产质量监控

l  mRNA疫苗制备和生产过程工艺条件优化和质量控制等。

试剂盒组成：

注：测定次数是指：包括用于标准曲线法标准样品的测定、比例法标准样品的测定和待测样品的测定所用试剂次数总和。

    试剂盒配套的T7 RNAP标准品是按照检测次数十分之一的量提供。

    本试剂盒所用T7RNAP聚合酶标准品溶液是经过特殊处理的，专门为本试剂盒配套使用的，市售的T7 RNAP无法在本试剂盒中定量使用。

检测步骤

1）  试剂盒中的试剂尽量避免反复冻融，以免丧失活性。第一次使用时，将试剂盒中的全部试剂分别在冰水浴中融化，根据用户自己每次测定样品的个数分装成合适体积，按照试剂盒的保存条件冷冻保存。

2）  取出分装好的试剂A、B、C和T7 RNAP标准品，置于冰浴中融化，分别取7µL试剂A，6µL试剂B和2µL试剂C加入到同一个经过冰浴冷却的1.5mL的塑料离心管中，并保持离心管一直在冰浴环境，根据样品中T7 RNAP活性含量，向上述离心管中加入1-5µL待测样品(待测样品需要将T7 RNAP活性含量稀释一定的倍数至检测活性范围内)，不足5µL的部分用无菌去离子水补足到5µL。

3）  将上述加入了总共20µL溶液的1.5mL离心管混匀，并在4℃，1000rpm下离心1分钟，然后放入34℃水浴摇床上反应60min。待反应时间结束时，快速加入980µL冰冷的经过灭菌的去离子水混匀，得到荧光待测液，并放置在冰水浴中。

4）  为了定量计算T7 RNAP活性，在测定样品时，需要同时按照1）~3）的步骤做一个加入T7 RNAP标准品的样品检测。

5）  分别取200µL步骤3）中的荧光待测液(包括步骤4)的标准品荧光待测液)至黑色Costar 96孔板，用荧光酶标仪在激发波长460nm，发射波长510nm，增益值为100情况下测定荧光值。与步骤4）标准品样品的荧光值进行比较，按比例计算出样品T7 RNAP活性值。

6）  建议：为了保证测定数据的稳定性，建议一次测定多个样品，同时进行一个T7 RNAP标准品的检测作为参比值，先计算所需要试剂的总体积，然后将试剂A、B和C混合，分别取15µL加入到1.5mL塑料离心管中，再按照实验的需要加1-5µL待测样品。

参考文献：

[1] Mingxin Cui, Okei Wong, Qiang Li, Wenya Wang, An Assay Method for Characterizing Bacteriophage T7 RNA Polymerase Activity by Transcription–Translation (TX-TL) System, The Journal of Biochemistry, 2023;, mvad002, https://doi.org/10.1093/jb/mvad002